A infecção pelo SARS-CoV-2 é marcada por diversas particularidades em aspectos clínicos e diagnósticos. Mesmo para testes diagnósticos clássicos, a interpretação dos resultados diante de pacientes sintomáticos ou assintomáticos pode ser desafiadora, uma vez que difere do que ocorre em outras doenças.

A possibilidade de reinfecção e a introdução de vacinas aumentou o interesse por métodos que pudessem ajudar a determinar o status imune de um indivíduo, adicionando importância no conhecimento em relação a alguns métodos, sendo a sorologia um dos mais solicitados. Contudo, será que esse método é realmente útil para esse objetivo?

Para responder a essa pergunta é importante entender que a reação imunológica a uma infecção viral é, didaticamente, uma combinação de duas respostas do organismo: celular e humoral (anticorpos).

Seja no curso natural da infecção ou após um esquema vacinal, na maioria dos casos, ocorre uma indução da produção de anticorpos ligantes, neutralizantes ou não, pelo sistema imunológico. Tendo em vista que a imunidade celular é difícil de se mensurar e avaliar, a quantificação de anticorpos é frequentemente utilizada como um marcador da resposta humoral.

Entretanto, nem todos os anticorpos produzidos são responsáveis pela proteção contra a infecção. Ao mesmo tempo, nem todos os anticorpos são detectados por métodos comercialmente disponíveis. Dessa forma, sorologias convencionais podem ser indicativos de imunidade ou simplesmente marcadores de contato prévio com determinado agente.

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Essa distinção não é nova e varia de acordo com a infecção. Para a maioria das doenças, a detecção de anticorpos IgG indica contato prévio e imunidade. Exemplos típicos são anticorpos anti-HAV que podem inclusive ser utilizados para avaliar necessidade de vacinação. Em outros casos, como a febre amarela, esses anticorpos não se correlacionam com proteção e os chamados anticorpos neutralizantes são utilizados para avaliar imunidade.

No caso da Covid-19, a realização de sorologias convencionais IgM e IgG não são recomendadas para o diagnóstico de infecção aguda e nem para avaliação de imunidade, sendo úteis principalmente em inquéritos sorológicos populacionais ou em situações em que a determinação de contato prévio com o vírus seja de interesse.

A disponibilização de métodos comerciais que detectam anticorpos neutralizantes contra o SARS-CoV-2 é uma novidade e que poderia ter maior correlação com o status imunológico. Para que esses métodos sejam utilizados da melhor forma é importante entender como funcionam, suas características e limitações.

A estrutura do SARS-CoV-2 

O agente etiológico da Covid-19 é um beta-coronavírus de material genético RNA de sentido positivo não segmentado e envelopado, composto de algumas glicoproteínas (antígenos) estruturais e não estruturais, incluindo a spike (S), nucleocapsídeo (N), envelope (E) e membrana (M).

A glicoproteína S (um tipo de glicoproteína de membrana tipo I), é formada por duas subunidades funcionais: S1 e S2. A primeira é responsável pela ligação a alguns receptores de membrana na superfície da célula hospedeira (notadamente ao receptor da enzima conversora da angiotensina 2 – ACE2). Já a segunda possui a função de proporcionar a fusão do vírus às membranas celulares.

O domínio B (SB) da subunidade S1, por sua vez, é a região exata onde a proteína S liga-se, com alta afinidade, ao receptor ACE2. Esse domínio, também chamado de domínio de ligação ao receptor (RBD, do inglês receptor-binding domain), interage com o receptor ACE2 da célula hospedeira, levando a endocitose e posterior replicação viral.

Anticorpos neutralizantes (nAb): o que são, diferença para o IgG e como avaliá-los

Como o próprio nome sugere, os anticorpos neutralizantes são aqueles que são capazes de bloquear (neutralizar) efetivamente a interação do agente patogênico à célula hospedeira. No caso específico da Covid-19, eles inibem a ligação entre o RBD da glicoproteína S e o ACE-2, impedindo a entrada do vírus à célula-alvo e, em última análise, a sua replicação.

E essa é a sua grande diferença (e vantagem) em relação aos anticorpos IgG, já que estes podem se ligar a diversas glicoproteínas virais e em suas diferentes sub-regiões (domínios), não necessária e especificamente ao RBD. Assim, é possível que alguns pacientes, embora com altas concentrações de IgG, possam não apresentar quantidades significantes de anticorpos neutralizantes na circulação.

Classicamente, os ensaios de neutralização viral são realizados por meio do teste de neutralização por placas (PRNT), técnica considerada padrão-ouro, ou por algumas de suas variantes, como o ensaio de neutralização de pseudovírus (pVNT). Esses ensaios biológicos simulam, in vitro, a infecção viral e sua interação com os anticorpos em uma cultura de células e vírus vivos.

Embora sejam metodologias altamente sensíveis e específicas, elas estão restritas a centros de pesquisa, devido à sua alta complexidade, custo, elevado tempo de processamento e de seu baixo rendimento. Além dessas limitações, em decorrência de suas particularidades analíticas, requerem profissionais especializados, em ambientes com altos níveis de biossegurança, já que há a manipulação de vírus vivos potencialmente infectantes.

Atualmente, existem 4 kits comerciais aprovados, sob registro padrão, pela Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), que funcionam como testes de anticorpos substitutos, possuindo um ótimo desempenho analítico. Esses ensaios e seus resultados são validados, ou seja, sua concordância de títulos neutralizantes é confrontada, frente aos testes de neutralização convencionais. Dois deles utilizam ensaios imunoenzimáticos, enquanto que os outros dois kits são baseados na metodologia de imunofluorescência (FIA).

Todos os testes aprovados, até o momento, são ensaios qualitativos para avaliação de anticorpos totais neutralizantes circulantes. Eles mimetizam a interação (proteína-proteína) entre RBD e o receptor ACE2, indicando a capacidade de inibição da formação desse imunocomplexo (RBD-ACE2) pelos anticorpos neutralizantes.

A depender do ensaio, o cut-off (limite entre positivo e negativo) é de 20% ou 30% de anticorpos neutralizantes, podendo assim ser utilizado para a interpretação da taxa de inibição. Seu significado, portanto, pode assim ser resumido: ≥20%-30% indicam a presença de anticorpos neutralizantes, enquanto que valores <20%-30% sugerem a não detecção desses anticorpos.

Avaliação de soroconversão (infecção natural ou pós-vacinal)

Com o recrudescimento da pandemia e o início da vacinação em nosso país, se faz necessário compreender e interpretar alguns dos exames disponíveis para a detecção de anticorpos, bem como suas peculiaridades analíticas e limitações em relação a algumas vacinas.

Resumidamente, os ensaios sorológicos utilizam determinados antígenos do patógeno em sua formulação, os quais os eventuais anticorpos da amostra se ligam, sendo mensurados posteriormente. Na Covid-19, os principais antígenos utilizados nos kits diagnósticos são o RBD, a proteína S, a subunidade S1 e/ou a proteína N.

Existem testes disponíveis, tanto de anticorpos totais quanto de IgG que, devido às suas características analíticas, podem apresentar uma boa correlação com os níveis de anticorpos neutralizantes (notadamente os ensaios anti-RBD, anti-S1 e/ou anti-S), embora não sejam específicos para esse fim. Esses testes também podem auxiliar na triagem e seleção de doadores de plasma convalescente em estudos e terapias em andamento.

Os kits que utilizam a proteína S (ou partes da mesma, incluindo o RBD) são uma alternativa viável para se avaliar a soroconversão, seja em pacientes com contato prévio/recuperados da doença em si, ou após o esquema de qualquer das vacinas atualmente disponíveis.

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Os ensaios que foram desenhados para a detecção de anticorpos IgG contra a proteína N, também podem ser utilizados para avaliar os anticorpos induzidos pela infecção natural, embora em geral com menor correspondência com os anticorpos neutralizantes.

A grande desvantagem desses ensaios é que, devido ao fato dos anticorpos estimulados por algumas vacinas (ex.: Oxford-AstraZeneca, Pfizer, Sputinik V, Moderna) serem direcionados contra a proteína S, os kits diagnósticos que utilizam a proteína N como princípio antigênico podem gerar resultados falsos negativos. Dessa maneira, esses testes somente devem ser utilizados para se avaliar a viragem sorológica após as vacinas que induzam também a produção de anticorpos contra a proteína N (ex.: CoronaVac-Sinovac, Covaxin).

Já os exames imunológicos disponíveis para a avaliação de anticorpos neutralizantes são específicos para a detecção desse tipo de anticorpo, já que eles foram desenhados e validados para essa finalidade. Para uma melhor sensibilidade, eles devem ser solicitados de 14-21 dias do início dos sintomas ou da segunda dose da vacina. Portanto, eles podem auxiliar tanto na avaliação de indivíduos que já tiveram contato/infecção natural, quanto na soroconversão pós-vacina.

Limitações 

• Ainda não foi definido qual o tempo necessário para a soroconversão, nem tampouco a dinâmica da produção e duração/estabilidade dos anticorpos ao longo do tempo, especialmente em vacinados.
• A falta de padronização dos kits entre os fabricantes faz com que diferentes antígenos, unidades de medida e pontos de corte sejam utilizados pela indústria diagnóstica, o que torna inviável a comparação entre os diversos ensaios disponíveis.
• Não há comprovação, até o momento, de que a presença de anticorpos neutralizantes circulantes confira proteção ou possa interromper a transmissão, já que a resposta humoral ainda não foi correlacionada à imunidade.
• Um resultado negativo não exclui a possibilidade de contato prévio ou da infecção aguda, não devendo, portanto, servir como um único critério para se traçar algum tipo de conduta.
• Com o aparecimento e circulação de novas variantes, a depender do grau e local das mutações, os ensaios sorológicos (e até mesmo os moleculares), podem apresentar uma piora de seu desempenho analítico, gerando assim resultados inconsistentes.
• Alguns indivíduos podem não soroconverter, embora apresentem algum grau de imunidade celular. Assim como todo exame de detecção de anticorpos, os testes sorológicos não devem ser utilizados para o diagnóstico de pacientes na fase aguda da doença.
• Existe a possibilidade de reações cruzadas, dentre as quais podemos citar: outras coronaviroses endêmicas, anticorpos heterofilos, fator reumatoide, uso de biotina (vitamina B7), terapia com anticorpos monoclonais, viroses.

Prática clínica

Devido a essas e outras limitações, até o momento, a determinação da viragem sorológica não é recomendada formalmente para se avaliar uma possível imunidade (natural ou após a vacina) contra a infecção.

Da mesma forma, pessoas vacinadas, mesmo com esquema vacinal completo, ou que já apresentaram infecção natural, ainda que recente, não estão isentas das medidas protetivas preconizadas, mantendo-se a recomendação do uso de máscaras, higienização frequente e adequada das mãos e a prática do distanciamento social.

Considerações finais

Embora ainda demande algum tempo até que algumas questões sejam devidamente esclarecidas, há fortes indícios que os testes sorológicos (anticorpos totais, IgG ou neutralizantes), podem possuir um papel chave na avaliação da infecção prévia, bem como sobre a eficácia e imunogenicidade das vacinas.

Os testes sorológicos específicos para a identificação de anticorpos neutralizantes, possuem um grande potencial para a avaliação de uma possível imunidade contra a Covid-19. Entretanto, eles devem serem interpretados com muita cautela, sempre em conjunto com as informações clinico-epidemiológicas, outros dados de exames complementares e às particularidades analíticas dos testes.

Os resultados desses testes não devem ser utilizados para recomendar a suspensão de medidas protetivas contra Covid-19, lembrando que as mesmas são importantes tanto do ponto de vista individual quanto coletivo.

Referências Bibliográficas:

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