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Microbiologia: em que consiste, características e utilidade da coloração de Gram

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Extensa variedade de espécimes bacterianos pode ser isolada nas amostras biológicas, com vistas ao diagnóstico do agente etiológico de uma infecção. Uma das principais formas de se categorizar as bactérias, consiste na análise de suas características morfotinturiais (forma, arranjos/grupamentos das células e sua afinidade pelos corantes).

Uma das etapas mais importantes para o auxílio diagnóstico do patógeno causal de uma infecção, consiste na sua análise microscópica direta, através do material biológico obtido diretamente do local onde se pretende investigar (o mesmo material que será utilizado para a cultura).

Para o exame bacteriológico direto, existem diversos métodos de coloração que podem ser utilizados no laboratório de microbiologia clínica (ex.: tinta nanquim, Ziehl-Neelsen, Albert-Laybourn), sendo a coloração de Gram, indiscutivelmente, a mais amplamente disponível e utilizada.

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Coloração de Gram

É uma técnica de coloração secular, descrita em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, que consiste na preparação de um esfregaço em lâmina de vidro para microscopia, de preferência da porção mais purulenta/sanguinolenta da amostra.

No caso de líquidos corporais, pode-se realizar uma citocentrifugação para se concentrar o material, obtendo assim uma melhor visualização das estruturas. A amostra é então mantida em ar ambiente para sua secagem e fixada por metanol ou por meio de um leve aquecimento. Um corante (cristal violeta) é adicionado, por um a dois minutos, e, em seguida, inserido o lugol, também por um a dois minutos. Dessa reação, forma-se o complexo iodo-pararrosalina na parede celular das bactérias, que coram-se de roxo (nessa fase, tanto as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas retêm o corante).

Na próxima etapa, após a lavagem da lâmina, inicia-se a etapa de descoloração, acrescentando-se uma solução de álcool-éter ou de álcool-acetona ao material. Nesse momento, em virtude das diferenças entre a constituição das paredes celulares (as bactérias Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicanos e de ácidos teicóicos, já nas Gram-negativas essa camada é mais delgada, com maior proporção lipídica), as Gram-positivas resistem à descoloração, retendo o corante, permanecendo roxas. Em contrapartida, as finas e lipídicas paredes celulares das bactérias Gram-negativas, quando expostas ao álcool, fazem com que as mesmas percam o corante, tornando-se incolores.

Na fase de contra-coloração, após uma lavagem da lâmina com água, é adicionado safranina (corante de cor vermelha), o qual é o responsável pela coloração avermelhada das bactérias Gram-negativas. Nova lavagem com água é realizada, secando-se cuidadosamente o material em seguida. A lâmina é então colocada no microscópio, sendo primeiramente visualizada em objetiva de pequeno aumento, para em seguida ser observada em objetiva de imersão em óleo (aumento de mil vezes).

Mais do autor: Qual a importância da ordem correta na coleta de exames laboratoriais?

Alguns exemplos de bactérias, suas características morfotinturiais e respectivas infecções mais relacionadas:

  • Cocos Gram-positivos: Staphylococcus aureus (infecções de pele e partes moles, síndrome do choque tóxico, bacteremia); Streptococcus pyogenes (infecções de pele e partes moles, faringite e suas complicações não supurativas), Streptococcus agalactiae (meningite, bacteremia neonatal); Streptococcus pneumoniae (pneumonia comunitária, meningite); Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium (bacteremia e infecções nosocomiais do trato urinário);
  • Cocos Gram-negativos: Neisseria meningitidis (meningite); Neisseria gonorrhoeae (gonorreia); Moraxella catarrhalis (otite média em crianças, sinusite, pneumonia);
  • Bacilos Gram-positivos: Listeria monocytogenes (meningite, bacteremia); Nocardia sp. (pneumonia, infecções de partes moles, abscesso cerebral); Bacillus anthracis (infecções de pele e partes moles, pneumonia, utilizado como um agente de bioterrorismo); Corynebacterium diphtheriae (difteria);
  • Bacilos Gram-negativos: Escherichia coli (infecção do trato urinário, diarreia, bacteremia); Klebsiella pneumoniae e Klebsiella oxytoca (infecção do trato urinário, diarreia, bacteremia); Proteus sp. (infecção do trato urinário); Salmonella sp. (diarreia, febre tifoide); Shigella sp. (diarreia); Enterobacter sp. (pneumonia nosocomial, infecção do trato urinário, bacteremia); Serratia sp. (pneumonia nosocomial); Pseudomonas aeruginosa; Acinetobacter baumanii; Campylobacter; Helicobacter; Legionella sp.; Bordetella sp.; Brucella sp.; Haemophilus sp.

Limitações da técnica

Dentre as limitações da coloração de Gram, podemos destacar:

  • Fornece um diagnóstico presuntivo/preliminar;
  • Só é capaz de identificar até o gênero bacteriano, não sendo possível, na maioria dos casos, o diagnóstico a nível de espécie;
  • Necessita de um grande número/concentração de patógenos na amostra para uma melhor sensibilidade;
  • Baixa acurácia em espécimes clínicas que possuem naturalmente alta presença de flora bacteriana normal (ex.: fezes, swab orofaríngeo e retal, pele);
  • Alguns microrganismos não se coram adequadamente pelo Gram (ex.: Treponema pallidum, espécies de Legionella, Mycoplasma e Mycobactérias).

Conclusão

Apesar de ser uma técnica antiga, possuir algumas limitações e da disponibilidade de técnicas mais avançadas de identificação bacteriana, a coloração pelo Gram ainda é muito utilizada nos dias de hoje pelo setor de microbiologia. Sua grande vantagem consiste na sua rápida, fácil e barata execução, fornecendo assim valiosas informações no sentido de orientar o diagnóstico presuntivo, o início precoce e guiado do tratamento e a avaliação, pelo laboratório clínico, da qualidade da amostra coletada.

Autor:

Referências bibliográficas:

  • Jacobs DS, Demott WR, Oxley DK. Jacobs & demott laboratory test handbook with key word index, 5th ed. Hudson, OH: Lexi-Comp, Inc; 2001.
  • Kanaan S. Laboratório com interpretações clínicas. 1a ed. Rio de Janeiro: Atheneu; 2019.
  • McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 23rd ed. St. Louis, MO: Elsevier; 2017.

Um comentário

  1. Avatar

    Ótima abordagem, fundamental p análise microbiológica, de qualidade.

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