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Exemplo gráfico de bacilos como a Mycobacterium tuberculosis sob efeito de corantes

O Mycobacterium tuberculosis e a clássica coloração de Ziehl-Neelsen

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Apesar de ser uma doença antiga, com diagnóstico clínico-laboratorial simples e de tratamento barato (gratuito no nosso país) e eficaz, a tuberculose pulmonar ainda é um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo.

Ela é uma doença infectocontagiosa, causada principalmente, porém não exclusivamente, pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, também conhecida como bacilo de Koch. É transmitida primariamente por gotículas infectadas (de 1 a 10 micrometros de diâmetro), expelidas por um paciente bacilífero previamente infectado, que se propagam pelo ar, até serem inaladas por um indivíduo sadio. Uma outra forma possível de transmissão, bem menos frequente, se dá pela inoculação direta através da pele não íntegra.

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O complexo Mycobacterium tuberculosis

O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) é formado por algumas espécies de micobactérias que, em maior ou menor escala, possuem a capacidade de ser transmitidas de pessoas para pessoas, característica que as fazem importantes epidemiologicamente.

Essas micobactérias são os agentes etiológicos da tuberculose humana, representadas pelo Mycobacterium tuberculosis (de longe a mais comum em nosso meio), Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, cepa de M. bovis Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii e Mycobacterium caprae.

Existem outras micobactérias que não pertencem ao MTBC, chamadas de “micobactérias não tuberculosas” ou “micobactérias outras que não bacilos da tuberculose”, já que são diferentes do bacilo de Koch. Elas podem ser divididas de acordo com o seu crescimento em meio sólido e na pigmentação de suas colônias, conforme proposto por Runyon em seu sistema de classificação: fotocromogênicas, escotocromogênicas, não fotocromogências e de crescimento mais rápido. Uma outra forma de classificação, clinicamente mais significativa, tem como base a sua patogenicidade em humanos.

Alguns exemplos de micobactérias não tuberculosas são elencados a seguir: complexo Mycobaterium avium (MAC), Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium haemophilum, dentre outras. O Mycobacterium leprae também é considerada uma micobactéria não tuberculosa, porém difere das demais pelo fato de, até hoje, ainda não ter sido isolada/cultivada in vitro.

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Diagnóstico bacteriológico e o método de Ziehl-Neelsen

Algumas bactérias não se coram adequadamente pelos métodos tradicionais de coloração (ex.: Gram). Dessa forma, o método de Ziehl-Neelsen, proposto por Franz Ziehl e aprimorado por por Friedrich Neelsen ainda no século XIX, é capaz de dividir as bactérias em dois grupos: as álcool-ácido-resistentes (ex.: micobactérias) e as não álcool-ácido-resistentes.

O método de coloração de Ziehl-Neelsen é utilizado para a detecção dos BAAR (bacilos álcool-ácido-resistentes). A alta concentração de ácidos micólicos em sua parede celular, faz com que a estrutura dessas bactérias tenha propriedades hidrofóbicas, tornando-as evidentes apenas quando submetidas a técnicas de colorações especiais. Morfotintorialmente, as micobactérias apresentam-se na forma de bacilos, sutilmente curvos ou retos, álcool-ácido-resistentes.

Outros métodos de coloração, como o de Kinyoum, e os com melhor sensibilidade, representados pelos corantes fluorocromáticos (ex.: auromina-O e auramina-rodamina), também são capazes de detectar as bactérias álcool-ácido-resistentes.

Passo a passo da coloração de Ziehl-Neelsen

  • Um esfregaço do material a ser investigado é colocado em uma lâmina de vidro para microscopia, com posterior fixação com calor;
  • A fucsina de Ziehl (corante avermelhado) é então adicionada por toda a lâmina, aquecendo-a até a emissão de vapores, repetidamente por 5 minutos, (deve-se tomar o cuidado para não ferver o corante). Nessa etapa, todas as bactérias presentes na amostra são coradas em vermelho;
  • O material então é lavado com água corrente, adicionando em seguida o substrato para descoloração (solução de ácido clorídrico 3% em álcool etílico), lavando-se a lâmina em seguida. Agora, as bactérias álcool-ácido-resistentes permanecerão vermelhas (já que resistem à descoloração), enquanto que as demais não conseguem reter o corante, ficando incolores;
  • Adiciona-se à lâmina uma solução de azul de metileno (corante azulado) por três minutos. Nessa fase, as bactérias que antes estavam incolores (não álcool-ácido-resistentes) coram-se de azul;
  • Novamente lava-se o material com água corrente, com posterior secagem do mesmo. Em uma objetiva de grande aumento (1000X) sob imersão em óleo, observa-se a lâmina a procura de bacilos retos ou ligeiramente curvados, avermelhados, com 0,2 a 0,6 micrômetros de largura e 1 a 10 micrômetros de comprimento, se mostrando como faixas, contas ou filamentos.

Existe uma convenção que o analista do laboratório utiliza para relatar a bacterioscopia dos BAAR nos laudos laboratoriais, em número de bacilos por campo microscópico examinado (c.m.e.):

  • Bacterioscopia negativa: ausência de BAAR em 100 c.m.e.
  • Bacterioscopia +: menos de 1 BAAR por campo em 100 c.m.e.
  • Bacterioscopia ++: 1 a 10 BAAR por campo em 50 c.m.e.
  • Bacterioscopia +++: mais de 10 BAAR por campo em 20 c.m.e.

Considerações finais

Um dos principais pilares para o adequado controle da tuberculose pulmonar baseia-se no seu diagnóstico laboratorial precoce, bem como o acompanhamento da eficácia do tratamento e a eventual ocorrência de resistência às drogas do esquema terapêutico.

A despeito do desenvolvimento de colorações mais sensíveis, da disponibilidade de identificação por culturas/testes bioquímicos, e de métodos diagnósticos moleculares para a detecção direta do ácido nucléico do Mycobacterium tuberculosis, a coloração de Ziehl-Neelsen ainda é muito utilizada em nosso meio. É uma forma rápida, simples e barata para a identificação e monitoramento do tratamento da tuberculose pulmonar, apresentando grande relevância clínico-epidemiológica para o enfrentamento dessa doença.

Autor(a):

Referências bibliográficas:

  • Jacobs DS, DeMott WR, Oxley DK. Jacobs & Demott Laboratory Test Handbook with Key Word Index, 5th Hudson, OH: Lexi-Comp, Inc; 2001.
  • Kanaan S. Laboratório com interpretações clínicas. 1a Rio de Janeiro: Atheneu; 2019.
  • McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 23rd St. Louis, MO: Elsevier; 2017.

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